吴俊教授：狼疮抗凝物的实验室检测及临床应用进展

  实验室要充分了解LA检测的仪器、方法和试剂性能，积极与临床科室沟通，才能为临床提供更准确的检测结果。

  本文刊载于《临床实验室》杂志2022年12月刊“自身免疫性疾病实验诊断”

  专题-「专家论坛」版块 作者：李静 吴俊 单位：北京积水潭医院医学检验中心

  【摘要】狼疮抗凝物（lupus anticoagulants，LA）是一组能直接与磷脂或磷脂蛋白复合物结合的自身抗体，是辅助诊断抗磷脂综合征（antiphospholipid syndrome，APS）的重要实验室指标。由于LA本身的异质性和受到抗凝药物的影响，其检测的新方法的标准化程度较低。

  ISTH 2020年更新的指南指南推荐的LA 检测可分为以下3个流程：（1）筛查试验：磷脂依赖的凝血试验延长，提示有几率存在凝血抑制物；（2）1∶1 混合试验：排除凝血时间延长是由于凝血因子缺乏所导致；（3）确证试验：试剂中含高浓度磷脂，若凝血时间被纠正则证实凝血抑制物具有磷脂依赖性。

  基于LA在体外与磷脂结合可延长磷脂依赖的凝血试验时间的原理，理论上只要试剂中的磷脂浓度低到足以对LA敏感，所有依赖磷脂的凝血试验都适用于LA的筛查，临床中常用的试验包括反映内源性凝血途径和共同途径的APTT、高岭土凝固时间（kaolin clotting time，KCT）和二氧化硅凝固时间（silica clotting time，SCT），以及反映共同途径的稀释蝰蛇毒时间试验（dilute Russell viper venom test，dRVVT）等试验。若样本中存在LA则会抑制具有凝血活性的磷脂，从而使凝固时间延长。其中KCT由于高岭土的颗粒性质可能会干扰凝血仪的光学凝块检测系统，并且结果重复性欠佳，临床中应用已慢慢地减少，目前临床更多使用SCT作为LA的筛查试验。

  由于LA的异质性，因此没有单一的检测的新方法对LA是100%敏感的。2009年和2020年的ISTH指南均建议，对LA的检测应包括两种不同原理的测试，首选dRVVT和以硅作为激活剂的APTT即SCT，可提高LA检测的敏感性。BCSH 2012和CLSI 2014同样推荐dRVVT和APTT，但未对激活剂种类进行限制。ISTH不建议进行两种以上的检测的新方法，认为这会导致结果难以解释，并且会增加LA的假阳性因此导致临床可能会进行不必要的抗凝治疗。CLSI 2014则认为即使筛查试验没办法避免出现假阳性结果，但后续的混合试验和确证试验能够直接进行排除。

  混合试验是在一份未经稀释的血浆样本出现了凝血时间延长的情况下，将待测血浆与等体积的正常血浆（normal plasma pool，NPP）1:1混合均匀，未经孵育前进行相应筛选项目测定，如凝血时间延长仍未被纠正，则排除了磷脂依赖性凝血时间延长的原因是一种或多种凝血因子缺乏，假定存在凝血抑制成分。必须要格外注意的是，混合试验并不能证明这种抑制成分就是LA。混合试验中的NPP能够正常的使用市售的商品试剂或实验室内自行配制， ISTH 2020指南建议应混合至少40例健康人的乏血小板血浆样本，以确保提供完整的凝血因子。

  关于实验流程的选择，ISTH 2009指出在筛查试验检测结果延长时即有必要进行混合试验，混合试验结果阳性时再进行确证实验。BCSH 2012则认为混合试验中的稀释效应可能会引起弱阳性LA检测结果出现假阴性，因此即使混合试验结果阴性，但筛查试验和确证试验检测结果提示阳性时仍然判定LA为阳性。CLSI 2014则强调检测流程依次为筛查试验、确证试验、混合试验，只有当筛查试验和确证试验的结果难以解释时再进行混合试验。ISTH 2020将建议顺序修改为，在筛查试验检测结果延长后一起进行混合试验和确证试验。

  确证试验的基础原理是通过加入含有高浓度磷脂的试剂来中和血浆中的LA在体外试验中的抗凝作用，以此来确认循环抗凝物有没有磷脂依赖性。当待测血浆中存在LA时，在加入含高浓度磷脂的试剂后血浆凝固时间缩短。ISTH 2009和2020指南均不建议将冷冻后复融的血小板作为确证试验的磷脂来源，因为批间差异较大，而是建议在确证试验中使用合成的双分子层或六边形II相结构的磷脂。BCSH 2012和CLSI 2014均未限定试剂类型。

  目前大多数实验室都遵循ISTH 2009指南的建议，在检验报告中将所有试验（筛查、混合和确证）的凝血时间转换为标准化的比率来表达，即将检测样本的凝血时间除以平行检测的NPP的凝血时间。对于采用综合试验即对每个样本一起进行筛查试验和确认试验时，则可计算凝血时间纠正百分比［凝血时间纠正百分比=（筛查试验比值－确认试验比值）/筛查试验比值 ×100%］，或标准化LA比值，即筛查试验比值/确认试验比值的比值。同时，LA的检测结果必须与筛查、混合和确证试验设定的cut-off值作比较，以确定检测样本是否为阳性。指南建议实验室至少检测120个样本选取第97.5或99百分位数作为自己的cut-off值，但真实的操作难度较大，大部分实验室选择对试剂生产商提供的cut-off值做验证后使用。目前的指南要求，只要两种测试中一项呈阳性即为LA阳性。完整的报告应包含所有试验的分析结果、cut-off值以及最终的结论。

  LA检测中的主要混杂因素是抗凝治疗，因为任何抗凝药物都可能会延长测试的凝血时间。对于使用普通肝素或低分子肝素的患者样本，可采用包含肝素中和剂的商品试剂将肝素淬灭。对于直接口服抗凝剂的患者样本，使用新型抗凝药吸附剂是一种有应用前景的解决方案。对于使用维生素K拮抗剂的患者样本，目前可采取受其影响较小的太攀蛇/锯鳞蝰蛇毒液作为激活剂的试剂盒进行仔细的检测。不建议对血浆样本做稀释来规避抗凝剂对试验产生的影响，因为会出现假阳性或假阴性结果。

  APS分类规定要求在有临床症状的同时还要存在持续中高滴度阳性的LA、IgG或IgM型的抗心磷脂抗体（anticardiolipin，aCL）和抗β2-GP1（anti-β2-glycoproteinⅠ，anti-β2GPⅠ）中至少一项（两次检验测试阳性，间隔时间大于12周）。在最近欧洲抗风湿病联盟（European Alliance of Associations for Rheumatology，EULAR）关于APS管理的建议中，将高风险特征定义为持续存在LA、双aPL（LA、aCL和抗β2GP1中任意两项阳性）或三重aPL（LA、aCL和抗β2GP1阳性），或持续存在的高滴度aPL。而一过性的LA阳性也许会出现于肿瘤患者、感染性疾病患者和极少数健康人群。

  LA通过诱导组织因子表达、干扰凝血酶原活性、激活血小板和血管内皮细胞、影响补体活化、抑制蛋白C，导致血栓的形成。Koji Habe等研究报道，在APS及其相关血栓性疾病中，63.5%的患者LA检验测试阳性。并且，在已发生了血栓事件的患者中，复发风险最高的是LA阳性的患者。此外，还有研究报道在LA检测中DRVVT和APTT试验同时阳性的患者比单一试验阳性的患者更易发生血栓。

  aPL阳性是血栓形成和病态妊娠发生的危险因素。在病态妊娠的发生过程中，aPL会干扰前列环素的合成，因此导致胎盘有产生血栓的风险。aPL能够最终靠抑制抗凝血蛋白Ⅰ和抗凝血酶Ⅲ的激活，干扰蛋白Ｃ的活性，灭活蛋白Ｓ和蛋白Ｃ对Ｖ因子的活性促进血栓形成、造成细胞免疫平衡紊乱、过度活化补体系统、损伤滋养细胞功能导致病态妊娠，造成胎盘供血不足导致胎儿缺血缺氧，引起流产、胎儿窘迫、子痫前期等并发症。

  综上所述，实验室要充分了解LA检测的仪器、方法和试剂性能，积极与临床科室沟通，才能为临床提供更准确的检测结果。