苏云金芽胞杆菌剂型研究进展

  苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）杀虫剂是目前世界上产量最大、应用最广、对人畜及天敌安全、不破坏生态平衡的微生物农药，大范围的使用在防治农业、林业、贮藏害虫以及环卫昆虫。然而，苏云金杆菌制剂存在持效期短，防治效果易受阳光、温度、湿度、雨水等外界气候和生态条件制约等缺点，野外试验残效期一般为3~7d，而且日平均气温越高，芽胞和晶体失活速度越快。苏云金芽胞杆菌田间应用残效期短已成为制约该杀虫剂发展的瓶颈，怎么样提高其杀虫效果是相关科研单位和生产企业所共同面临的难题。剂型加工与药效发挥有直接关系，苏云金芽胞杆菌制剂在应用中暴露的这样一些问题，通过剂型的改进是能够获得解决的，加强剂型研究既具有理论价值又能解决实际问题。本文介绍了近十年国内外苏云金杆菌剂型的研究进展。

  油悬剂（Oil formulation）是指一类用经过试验可当作菌剂助剂且不污染作物的油类作为载体的一种剂型，油类包括植物油或矿物油。作为稀释剂，要求油类本身就具有良好的粘着性和展着性，容易粘附于蜡质或光滑的叶面，所以油剂具有粘着性和展着性好、抗雨冲刷能力强等优点。刘明秋等将苏云金芽胞杆菌原粉悬浮于矿物油中制备出油剂剂型，并对所研制的油剂进行了增效因子筛选，以小菜蛾和棉铃虫为供试昆虫，结果表明，氯化镁、硫酸镁和碳酸钠具有较好的增效作用，通过控制不同的添加比例，增效比在1.56~1.69之间。

  超低容量油剂具有浓度高、用量少、对叶面粘着力强的特点，但该剂型在挥发性、闪点、粘度及有效成分稳定性方面均有严格要求。湖北省农业科学院生物农药工程研究中心筛选了闪点高、粘度小、挥发性低的溶剂以及具有优良触变流动性能的助剂，与效价55000 IU/mg的苏云金杆菌原粉配制成超低容量的油剂，原药在制剂中的悬浮性及再悬浮性较好，闪点71℃，挥发性19.6%，毒力保持率69%~97%，对棉铃虫的田间防效达85.3%~96.0%。

  微胶囊制剂（Microcapsule）是指将有效成分包在囊壁物质中制成几微米至几百微米的微小球体，靠改变囊壁厚度和孔径大小控制药物释放速度。20世纪80年代以后，苏云金芽胞杆菌微胶囊制剂研究日趋活跃，其中淀粉胶囊剂是近年来研究较多的一种类型，采用淀粉或面粉基质、无机盐作水分散剂来包裹苏云金芽胞杆菌。如果使用交联剂或预糊化淀粉则有利于淀粉在制备过程中的絮凝和沉淀。为了使淀粉包层有利于昆虫消化，可以在配方中添加具有选择联特征的聚合物，这些聚合物可以是非离子型的，也可以是阴离子或阳离子型的，它们本身能够被摄取昆虫的消化液所渗透，并能保证可溶性淀粉凝聚在苏云金芽胞杆菌周围。董彩虹等将α－淀粉、苏云金芽胞杆菌原粉和紫外防护剂混合均匀，加入适量溶剂溶解并交联， 40℃固化2h，室温风干，过20~40目标准筛制得淀粉包囊制剂，残效期明显高于未处理原粉。将苏云金芽胞杆菌半成品用甲基纤维素包囊后在乙醇中沉淀，加入紫外光防护剂即得到微胶囊悬液。如不加保护剂直接离心脱水，则得到400~500μm的微胶囊颗粒。除了淀粉包囊剂外，多价聚合物、生物降解材料等也可以用于制备苏云金杆菌包囊剂。Sun等使用了溶解度对体系pH值有依赖性的液体聚合物，首先在溶解状态下与增塑剂、增强剂、UV保护剂、生物农药等混合，然后进行干燥即得包囊制剂。Murray等认为，碳水化合物可能刺激病原体和生物体的生长，建议用具有收缩性的非淀粉材料制备包囊剂。由于微胶囊制剂加工成本高而且撒播时易随风雨从植物上掉落，在配方中添加烃基、氨基、丙烯酰基等阳离子聚合单体，能提高苏云金杆菌颗粒与带负电荷的植物叶片的粘合性，助剂Agri-Dex和Soy-Dex具有显著的抗雨水冲刷性能。

  截止目前，苏云金芽胞杆菌微胶囊制剂已开发了3种类型，一种是可喷洒性制剂，加水后形成的悬液可以直接用常规喷雾器喷洒。另一种是传统的颗粒饵剂，经过干、湿过程后颗粒之间仍保持相互分离。第3种是粘着性颗粒剂，与水接触后会发生部分膨胀，干燥后仍可粘着在作物叶片上。

  漂浮块剂是苏云金杆菌缓释剂的一种类型，主要用于蚊虫幼虫的防治。苏善强等用粘合剂、凝结剂和松散剂按一定比例混合，加热溶解、搅拌，冷却后按所需剂量加入苏云金杆菌H-14粉剂，压缩成边长1.5cm的正立方体块状缓释剂。经现场毒杀埃及伊蚊幼虫的实际效果显示，按剂量0.0005%投药后1个月，室内幼虫密度布雷图指数从投药前的123.26降至2.56；投药后3个月，室外布雷图指数从投药前的136.11降至3.33，灭蚊持效时间达3个月以上。用Bs C3-41灭蚊乳剂加聚乙烯泡沫粉和榆树皮粉，依次按7:1:2的比例混均，边搅拌边添加粘附剂（15%聚乙烯醇）和10%分散剂，制成厚1cm、长和宽均为2.5cm的块剂，效价160 ITU/μL。使用剂量4.8g/m2，48h后平均幼虫密度下降率33%~56%，持效期3个月以上。为了进一步提高块剂的释药功能，张吉斌等用Bs可湿性粉剂与惰性粉末、产气泡的碳酸氢钠混合，模压成2g的块剂。试验表明，这种发泡块剂的持效期为17d，而德国蚊虫防治协会的Bs-Ft发泡块剂的持效期只有9d。

  烟雾载药技术防治植物病虫害具有工效高、用药经济、使用方便、收效快等优点，尤其适用于交通不便、水源困难、山坡陡峭、林木高大的林区病虫害防治。张立钦等将苏云金芽胞杆菌粉剂悬浮于0号柴油中，采用脉冲式烟雾机进行烟雾雾化，经2号喷嘴（直径2.0mm）进行喷射，苏云金芽胞杆菌仍保持毒力，能直接对家蚕致死，烟雾中分离纯化的菌剂对家蚕毒力水平与原来一致。由于脉冲式烟雾机产生的气流速度很快，农药受高温作用的时间仅1ms，而生物大分子农药受热分解最快速度为5ms，因此苏云金芽胞杆菌的芽胞不会因烟雾机的高温而失活。烟雾颗粒的大小能影响苏云金芽胞杆菌扩散的高度和距离，4号喷嘴（直径3.0mm）效果明显优于2号喷嘴（直径2.0mm）。

  试验中还发现，油烟雾剂的杀虫效果随着虫龄和机械工作状态的稳定性能产生波动，其中烟雾机高温气流和机械性能对毒力的影响尚待深入研究。

  苏云金芽胞杆菌在防治林业害虫方面一直发挥着重要作用。受林业自身特性所决定，在覆盖面积较大的林区，飞机撒药具有优势。但对于一些小面积的森林，当地政府尚没有条件采用飞机施药，如果实施地面人工施药，劳动强度大，其用工费和运输费往往超过农药自身成本数10倍，这不但增加了生物农药推广的困难，也抵消了其应有的经济效益。为了克服这一难题，中国林业科学院亚热带林业研究所研制了苏云金芽胞杆菌火箭抛撒剂型。将苏云金芽胞杆菌工业菌粉进行复配后，装入火箭弹头，装菌量700g±50g。弹头将菌粉带到空中爆炸抛撒落粉，分布在防治目标的叶面上。弹头射高100～150m，射距200～300m，抛撒散落直径大于30m，抛撒环境温度低于65℃。经检测，抛撒后菌粉对马尾松毛虫的毒力效价不但没有下降，而且还因复配改良的原因有所上升。结果表明，这一抛撒方式有利于保护苏云金芽胞杆菌的生物活性，爆炸抛撒对菌粉芽胞也无不良影响。

  阳光中的紫外线（UV）是降低苏云金芽胞杆菌制剂田间防治效果的首要因素，紫外线辐射对伴胞晶体结构的破坏与活性氧的产生密切相关，长时间的UV照射可以破坏伴胞晶体的表面结构和形态，引起伴胞晶体蛋白一级结构和立体结构的改变，使之变性，难溶于碱性液和昆虫的胃液，不能降解为具有杀虫活性的毒素蛋白而失去杀虫活力。

  苏云金芽胞杆菌制剂直接与适量化学紫外线吸收剂混合，即可取得防护效果。徐莉等测试了3种二苯乙烯类荧光增白剂Tinopal LPW，VBL，JD-3对苏云金杆菌制剂毒力的影响，添加1%VBL的Bt制剂紫外线%腐殖酸对苏云金杆菌伴胞晶体有很强的光保护作用，紫外线kDa两种原毒素蛋白的SDS-PAGE谱带几乎无任何变化。粉被虫草、古尼虫草的培养液、菌丝浸提液以及胞梗束浸提液所培养的苏云金芽胞杆菌有较强的抗紫外线特性。由于虫草产生的抗紫外辐射物质可直接被苏云金杆菌菌体吸收利用，其效果比加入防护剂来得更加直接与方便。

  苏云金杆菌制剂中加入水质素及蔗糖溶液，可以防止紫外线的伤害，提高残效期。木质素对芽胞和晶体皆有保护作用，木质素水溶液在pH8~11与生物杀虫剂和多价盐混合干燥即可制备分散配方，具有抗冲刷和阳光降解性能。刚果红、叶酸和对氨基苯甲酸溶液可以作为紫外线吸收剂，对苏云金杆菌HD-1起保护作用，延长它对欧洲玉米螟（Ostrinia nubilalis）的残效期，其中刚果红的效果最好。苏云金杆菌制剂中的填料及使用浓度也会影响抗紫外效果，稀释倍数越高，毒力下降越快。

  除了添加紫外线吸收剂外，选育紫外线抗性菌株的方法也有人在尝试。研究发现，苏云金芽胞杆菌以色列亚种比库斯塔克亚种对紫外线的抗性更强，并且这种抗性与培养时间有关，当细菌培养48 h后对UV的抗性达到高峰。进一步研究表明，这种抗性与芽胞上含有的一种小分子酸溶性蛋白（SASP）有关，它能赋予芽胞对热、UV和盐的抗性。用鸟枪克隆法从嗜麦芽假单胞菌中分离到控制黑色素形成的mel基因，并将之转入苏云金芽胞杆菌进行表达，得到的重组菌株所产生的黑色素具有天然黑色素的性质与功能，与出发菌株相比对UV有显著抗性。采用固氮蓝细菌表达苏云金芽胞杆菌以色列亚种杀蚊幼虫晶体蛋白毒素，可以免受透过大气臭氧层的紫外线带来的损伤。这种细菌可以在栖息地繁殖，对蚊幼虫实施有效地控制。

  苏云金芽胞杆菌水悬液剂贮藏稳定性差一直是困扰生产的一大难题，在室温下贮存时间一般不宜超过半年。随着研究的深入，对苏云金芽胞杆菌悬浮液化学助剂的选择有了更全面的认识。一个理想的苏云金芽胞杆菌杀虫剂的液体剂型应有良好的防腐剂以抑制苏云金芽胞杆菌自身和其他微生物的活动，有紫外线防护剂保护其田间药效，有表面活性剂使其能在植物叶面进行展着湿润，有保湿剂防止叶面雾滴干燥而使药剂脱落，有昆虫取食促进剂增加昆虫的食欲而提高单位时间内杀虫剂摄入量以及有增效剂提高杀虫效率等。芽胞在昆虫致病中也占有重要地位，各种助剂对晶体和芽胞的影响是不尽相同的，同一种助剂对晶体和芽胞的影响效应也可能不一致。因此，各种助剂的加入不仅要保护晶体，也不能杀死或抑制芽胞，也不应影响昆虫的取食。张俊亭等在上述原则指导下，研制的液体制剂经一年贮存，毒力效价仅下降11%，低于中华人民共和国农业行业标准NY293-95苏云金芽胞杆菌制剂中所规定的30%。彭可凡等研究了20种化学物质对苏云金杆菌毒力的影响，分析了由乳化剂、润湿剂、防腐剂配制的几种不同助剂组合与晶体芽胞混合物在不同贮存期的毒力变化及芽胞存活率，获得的最佳液剂配方在50℃±1℃热贮14d后，其效价仅下降11.43%。

  苏云金芽胞杆菌毒素是否会在环境中积累与以下3种因素有关：①使用的浓度；②昆虫消耗的速度；③紫外光及土壤、作物表面微生物群对其钝化和降解的速度。苏云金芽胞杆菌普通商业制剂由于残效期短，故不存在环境残留问题。但转Bt基因植物大面积推广使用后，这种认识发生了改变。由于转Bt基因植物在生长期内持续不断地向环境释放杀虫毒素，而当作物成熟后往往只收获其有经济价值的部分，大部分含有毒素的秸秆丢弃到田间，花粉飘落也可将毒素带入土壤生态系统。因此，转基因作物产生的毒素往往比商业苏云金芽胞杆菌制剂在土壤之中浓度更高，作用更持久。随后的研究发现，转基因作物释放的毒素很容易被土壤中的胶体矿物所吸附，吸附后的毒素比未吸附的游离毒素具有更高的杀虫活性，并且对微生物分解产生抗性，其杀虫活性可持续存在180d或234d。

  苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白被土壤胶体吸附后杀虫活性得以长期保持的特性，为长效耐降解剂型的研制提供了新思路。周学永等采用土壤矿物颗粒吸附杀虫蛋白，吸附后杀虫活性提高了近10倍，并且拥有非常良好的抗紫外光效果。（参考文献略）